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菌种鉴定

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CICC是我国唯一的国家级工业微生物菌种保藏管理中心,有近三十年菌种分类鉴定的历史,拥有先进的生物科学仪器和从事分类鉴定的专业化人员队伍,于2012年通过ISO 9001质量管理体系认证,2016年通过ISO 17025国家实验室认可,2018年通过CMA检验检测机构资质认定。CICC承担全国工业微生物菌种的委托鉴定工作,所提供的菌种鉴定与评价技术服务获得“国家工商总局(SCIC)经营许可”,为国内科研机构、大专院校和生产企业等提供微生物菌种鉴定服务,涉及细菌、酵母、放线菌和丝状真菌等多类微生物。菌种鉴定手段包括形态学观察、生理生化特性鉴定、 BIOLOG碳源自动分析鉴定、分子生物学鉴定、API细菌数值鉴定、功能性分析及功能基因、RAPD、SSCP、TLC薄层层析、全细胞脂肪酸分析鉴定、(G+C)mol%测定、DNA/DNA同源性测定等。

  鉴定程序

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菌种鉴定流程图 
说明:
  • 1.请务必仔细阅读、填写和提交《微生物菌种鉴定评价协议书》,未填写协议书的样品本中心将不予受理。 
  • 2. 业务受理:(1)现场办理:请您直接到北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼办理协议签订、付款、样品提交等手续。现场办理可接受现金、同城支票、银行转账的付款方式。(2)远程办理:您可以经电话咨询后,通过E-mail或传真提交《微生物菌种鉴定评价协议书》,通过邮寄提交样品,通过银行转账进行付款。
  • 3.样品邮寄:请标识送检样品名称或编号,并确保与《微生物菌种鉴定评价协议书》中填写的信息一致,样品如为菌种,请提供1支备份,并注意样品邮寄过程中的包装防护和温度防护。
  • 4. 送样要求:委托鉴定菌株应为非致病菌,且来源明确;若属于中华人民共和国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》之内菌株,CICC有权停止试验或加收20%鉴定费用。
  • 5.正常工作时间的每天上午09:00前收到样品(含邮寄样品和现场收样),则自当日起计算报告完成时间,如上午09:00后收到样品,则以次工作日起计算。星期六、日及公众假期为非工作日。
  • 6. 部分项目提供加急服务,费用为1.5倍,详情请来电咨询。
  • 7.依据菌种的种类、鉴定难易程度,鉴定费用有所不同,具体事宜请来电咨询。
  • 8. 鉴定技术服务执行预付全款制度,鉴定报告完成后将连同发票快递给客户。
  • 9.本中心原则上提供一份中文鉴定报告纸质原件,如客户要求增加出具英文鉴定报告、电子鉴定报告或鉴定报告副本,将酌情收取部分费用。

 

  鉴定项目

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CICC 菌种鉴定与评价服务项目

 

序号

项目编号

项目名称

周期/工作日

备注/适用范围

1 CICC-BSeq03 16S rDNA 3

细菌

2 CICC-YSeq03 26S rDNA  D1/D2 3

酵母

3 CICC-FSeq05 5.8S rDNA  ITS 5

小型丝状真菌

4 CICC-BSeq07 16S rDNA  7

细菌

5 CICC-YSeq07 26S rDNA  D1/D2 7

酵母

6 CICC-FSeq10 5.8S rDNA  ITS 10

小型丝状真菌

7 CICC-Identi 种水平鉴定

 

10

细菌、酵母

20

放线菌、霉菌

CICC-BHGen01 gyrA 基因 5

芽孢杆菌属

CICC-BHGen02 gyrB 基因 5

假单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属

10  CICC-BHGen03 pheS 基因 5

乳酸菌属、肠球菌属

11  CICC-BHGen04 recN 基因 5

明串珠菌属、链球菌属

12  CICC-BHGen05 rpoB 基因 5

葡萄球菌属

13  CICC-BHGen06 trpB 基因 5

链霉菌属

14  CICC-BHGen07 atpD 基因 5

双歧杆菌属

15  CICC-FHGen01 β-tubulin 基因 5

曲霉属、青霉属、毛霉属

16  CICC-FHGen02 calmodulin 基因 5

曲霉属、青霉属

17  CICC-FHGen03 EF1-α 基因 5

毛霉属、根霉属、木霉属

18  CICC-FHGen04 Actin 基因 5

毛霉属、根霉属

19  CICC-BIOLOG BIOLOG 7

基于C源代谢的自动化鉴定系统

20  CICC-API API  7

细菌、酵母

21  CICC-BIOM 生理生化 10

细菌、酵母

20

放线菌

22  CICC-BIOMN

生理生化(新种、特殊种)

30

如为潜在新种,参考新种发表试验要求

23  CICC-SEM 扫描电镜 10

形态学特征观察(形貌、表面)

24  CICC-TEM1 透射电镜(负染) 10

形态学特征观察(附属结构)

25  CICC-TEM2 透射电镜(切片) 10

形态学特征观察(内部 )

26  CICC-GC1 G+Cmol% 10

Tm值法含量测定

27  CICC-GC2 G+Cmol% 15

HPLC

28  CICC-DDH DNA-DNA杂交

 

15

菌种基因组DNA 同源性测定

29  CICC-Lipid 脂肪酸

 

8

细菌、放线菌化学分析

30  CICC-Quin 泛醌/甲基萘醌

 

8
31  CICC-PLipid 极性脂 8
32  CICC-CWS 细胞壁化学组分(糖) 8
33  CICC-CWA

细胞壁化学组分(氨基酸)

8
34  CICC-RAPD RAPD 15

菌株分型,用于菌种溯源,产权纠纷等

35  CICC-SSCP SSCP 15
36  CICC-RepP Rep-PCR 15
37  CICC-EricP Eric-PCR 15
38  CICC-BoxP Box-PCR 15
39  CICC-ARDRATyp ARDRA 酶切 10
40 CICC-RiboTyp

Ribotyping核糖体分型

15
41  CICC-PFGE 脉冲场凝胶电泳 25
42 CICC-Isolation 菌种分离纯化 15

混合样品中菌种的分离纯化

43  CICC-Count 特定菌菌落计数 15

乳杆菌、双歧杆菌、磷细菌、硝化菌、反硝化菌

44  CICC-GStab 遗传稳定性 30

生产菌种等遗传稳定性试验

45 CICC-Enzyme 酶活测定 10

蛋白酶/淀粉酶/果胶酶/植酸酶/纤维素酶/糖化酶/过氧化氢酶/脱氢酶/脲酶等

46  CICC-BSus 细菌药敏 15

琼脂扩散法/MIC/Etest

47 CICC-YSus 酵母药敏 15

MIC/Etest

48  CICC-FSus 小型丝状真菌药敏 15

MIC

49  CICC-BIOLOGECO

BIOLOG ECO板生态分析

15

微生物菌群分析,用于环境、水质、传统酿造行业等混合样品的非培养法微生物菌群分析

50  CICC-DGGE DGGE样品制备及检测

30

51  DGGE跑胶
52 

DGGE切胶、纯化、克隆、测序

53  DGGE结果分析
54  CICC-16SLib 样品制备及检测

30

55 

16S rDNA 克隆文库构建

56 

克隆子筛选及测序(200)

57  结果分析
58  CICC-MAnaly 产品微生物解析(培养法) 20

微生物发酵产品控制

59  CICC-Contamin 污染菌分析(培养法) 20
60  CICC-Phage 噬菌体检测(阴性) 5
61  噬菌体检测(阳性) 15
62  CICC-FBroth 发酵液制备(30L 15

——

63  CICC-RTPCR 标准品制备及检测

20

微生物定量分析,用于食源性致病菌、临床、工业等微生物菌种的相对定量/绝对定量分析

64  样品制备及检测
65  相对定量(Taqman探针法/SYBR Green 染料法)
66  绝对定量(Taqman探针法/SYBR Green 染料法)
67 结果分析
68 CICC-Clo 肉毒梭菌检测 7

SNT 2525-2010 食品中肉毒梭菌的PCR检测方法

69 CICC-virulence 菌种毒力 40

适用于微生物菌种安全性评价

70 CICC-antigene 菌种抗生素耐药性基因检测 15
71  CICC-antivirus 菌种抗病毒能力评价 30

适用于微生物菌种功能性评价

72 CICC-MetaC 代谢产物含量测定 10

酸、醇、酮等,适用于微生物菌种功能性评价

73 CICC-Fmor 形态学鉴定 20

小型丝状真菌

74 CICC-LAMP 环介导等温扩增 10

微生物快速诊断

75 CICC-metag 宏基因组分析 50

Miseq PE测序

76 CICC-wgen 全基因组测序 60

illumina Hisea2000

77

CICC-genoextra

核酸提取

10

微生物基因组/mRNA/RNA的高效提取

78

CICC-expB

蛋白质细菌表达系统的表达与纯化

35

无需修饰的蛋白质的高效表达系统构建,启动强度优化、质粒拷贝数优化、表达条件优化。

79

CICC-expY

蛋白质酵母表达系统的表达与纯化

35

蛋白质真核表达系统的构建,包括启动强度优化和表达条件优化

80

CICC-antipre

抗原设计与制备

60

大分子抗原(10kD以上)序列优及小分子抗原结构设计。抗原制备服务包括大分子、小分子、细菌、真菌等菌体抗原的制备。

81

CICC-antitag

抗体标记

20

生物素标记/酶标记/荧光素标记

82

CICC-antimT

抗原性物质定性及半定量分析

10

目的抗原:蛋白/小分子/细菌/病毒

83

CICC-proT

蛋白质定性定量分析

15

/

84

CICC-TOF03

MALDI-TOF MS快速鉴定

3

细菌、酵母菌、丝状真菌

85

CICC-TOF01

MALDI-TOF MS快速鉴定

1

细菌、酵母菌、丝状真菌

注:特殊样品交付周期适当延长,其最终解释权归CICC所有。

 

  专题服务项目

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一、菌株分型溯源专题

菌株分型技术基于微生物DNA指纹图谱分析和基因组DNA序列分析,是工业企业快速、准确、高分辨开展微生物菌株株水平鉴定、分子分型和溯源调查的有力工具。CICC建立了国际领先的微生物菌株分型技术平台,包括核糖体分型(Ribotyping)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机扩增DNA多态性(RAPD)和全基因组测序(WGS)等。

菌种分型与溯源项目

二、菌种安全性评价专题

在保健食品、新食品原料、特殊食品、食品添加剂、新饲料原料、新饲料添加剂等行业领域,微生物作为生产菌株或直接添加菌株,其安全性评价越来越受到国际国内政府监管的重视,法规要求不断更新,如:2020年国家市场监督管理总局发布《保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)》;2018年欧盟发布了饲料添加剂微生物菌株的安全性评价指南-用作饲料添加剂或生产菌株的微生物特征描述指南(EFSA Journal 2018;16(3):5206)。CICC长期跟踪国内外菌种安全性评价法规标准并积累了丰富的技术经验,目前可向工业企业全面开展微生物菌种安全性评价服务。

序号 项目编号 项目名称 周期
(工作日)
检测依据

1.    

CICC-IdentiB

细菌鉴定

15

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.23.3

FMIC-QO01-001-2015

2.    

CICC-IdentiF

真菌鉴定

20

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.23.3

FMIC-QO01-003-2015

3.    

CICC-IdentiY

酵母菌鉴定

15

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.23.3

FMIC-QO01-005-2015

4.    

CICC-RiboTyp

菌株鉴定( Ribotyping

20

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.3

SH-QO01-009-2019

5.    

CICC-wgen

CICC-SNP

菌株鉴定( WGS+SNP分析)

30

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.3

FMIC-QO01-021-2020

FMIC-QO01-023-2020

6.    

CICC-RAPD

菌株鉴定(RAPD

20

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.3

SH-QO01-003-2019

7.    

CICC-PFGE

菌株鉴定(PFGE

30

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.3

SH-QO01-002-2019

8.    

CICC-GStab

遗传稳定性

80

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.43.5

SH-QO01-014-2019

9.    

CICC-BSus

CICC-YSus

CICC-FSus

药物敏感性

20

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.7

CLSI M100-2020/CLSI M45-2015

CLSI M27-2017/CLSI M38-2017

10.   

CICC-Hemo

溶血性

20

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)3.7

SH-QO01-008-2019

11.   

CICC-wgen

CICC-Antigene

CICC-Virgene

全基因组测序(耐药、毒力、致病基因分析)

50

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)4.1

FMIC-QO01-021-2020

FMIC-QO01-024-2020

12.   

CICC-virulenceB

细菌动物致病性

80

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)4.2

附录A保健食品原料用细菌致病性检验方法

13.   

CICC-virulenceF

丝状真菌动物致病性

80

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)4.2

附录B保健食品原料用丝状真菌的致病性检验方法

14.   

CICC-virulenceY

酵母菌动物致病性

80

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)4.2

附录C保健食品原料用酵母的致病性检验方法

15.   

CICC-H18

CICC-H19

CICC-H20

CICC-H21

CICC-H22

CICC-H23

CICC-H24

CICC-H25

CICC-H26

CICC-H27

产毒(黄曲霉毒素B族、黄曲霉毒素M族、伏马毒素、桔青霉素、赭曲霉毒素A、展青霉素、杂色曲霉素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等)

30

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)4.3

GB 5009.22-2016/GB 5009.24-2016

GB 5009.240-2016/GB 5009.222-2016

GB 5009.96-2016/GB 5009.185-2016

GB 5009.25-2016/GB 5009.111-2016

GB 5009.209-2016/GB 5009.118-2016

16.   

/

结果判定与评价

15

保健食品原料用菌种安全性检验与评价技术指导原则(2020年版)5

 

三、2020版《中国药典》微生物检测专题

2020版《中国药典》逐步与国际水平接轨,针对微生物菌种管理、菌种检定、菌株分型、菌株溯源、生产过程微生物监测、环境微生物监测等内容进行修订和补充,对我国制药企业在微生物监控管理方面提出了新的要求和挑战。CICC针对客户需求,对制药企业在生产过程中的微生物控制,以及新药申报生产菌种检测等方面开展技术服务。

序号 项目编号 项目名称 工作日 2020版《中国药典》条款来源
  CICC-Identi 种水平鉴定 15-20 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制: 菌毒种的检定:生产用菌毒种应进行生物学特性、生化特性、血清学试验和分子遗传特性等的鉴定;细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:生产用菌种的种、属、型分类鉴定,包括形态、生长代谢特性和遗传特性;重组工程菌生产用菌种主种子批检定:一般应包括培养特性、菌落形态大小、革兰氏等染色方法镜检、生化反应。 人用疫苗总论:3.2细菌性疫苗种子批系统:菌种形态特性、培养特性、增殖能力。 人用重组DNA蛋白制品总论:2.2.3 细胞库的质量控制:应对主细胞库的表型和基因型标记进行鉴定。 人用基因治疗制品总论:2.3.3 细菌种子批:菌落形态、染色镜检、生化特性。 微生态活菌制品总论:3.1.3 种子批的检定:菌种的属、种、型分类鉴定,应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册和伯杰氏细菌命名手册的有关规定进行,包括形态、生长代谢特性检查。培养特性及染色镜检:将菌种接种于适宜培养基,置有氧或厌氧环境中培养,观察其生长情况,确定菌种为需氧性细菌或厌氧性细菌;以划线法观察在琼脂平皿上生长的单个菌落的形状、大小、表面、边缘、透明度、色泽等特征;也可观察菌种在不同温度、pH值或不同浓度的氯化钠溶液等条件下的生长特性等。生化反应:按细菌生化反应培养基(通则3605)选择相应的培养基或其他适宜的方法进行,结果应符合原始菌种的特性。可采用16S rRNA序列测定或其他适宜方法进行,应符合该菌种的遗传特性。 生物制品各论菌种检定:平板划线应呈典型集落形态,无其他杂菌生长;染色镜检应为典型形态;生化反应符合菌种反应特性。 9204 微生物鉴定指导原则:本指导原则为药物原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品和环境等中检出微生物的鉴定提供指导。包括表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定。
  CICC-Iso 分离纯化 10 9204 微生物鉴定指导原则:待检菌的分离纯化:微生物鉴定的第一步是待检培养物的分离纯化,最常用的分离纯化方法是挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线分离纯化,以获取待检菌的纯培养物(单个菌落),必要时可进一步进行纯培养,为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量菌体。
  CICC-Spuri 菌种纯度 20 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:培养物纯度;重组工程菌生产用菌种主种子批检定:培养物纯度。 人用疫苗总论:3.2细菌性疫苗种子批系统:同时应采取相对敏感的方法检测种子的菌株纯度,以保证菌株没有外源因子和杂菌污染;3.4 基因工程疫苗种子批系统:工作细胞库重点检测外源因子污染。 人用重组DNA蛋白制品总论:2.2.3细胞库的质量控制:应对细胞库进行支原体、外源病毒因子等相关微生物污染的检测,并确认细胞基质没有被污染。 人用基因治疗制品总论:2.3.3细菌种子批:应确保不存在其他细菌、真菌和噬菌体的污染。 生物制品各论菌种检定:应为典型形态,无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。按附录Ⅶ方法做纯菌检查,生长物做涂片镜检,应符合菌种特征,不得有杂菌。
  CICC-SEM 扫描电镜 10 人用基因治疗制品总论:2.3.3 细菌种子批,电镜检查。
  CICC-TEM 透射电镜 10 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:重组工程菌生产用菌种主种子批检定:透射电镜检查。 人用基因治疗制品总论:2.3.3 细菌种子批:电镜检查。 生物制品各论菌种检定:透射电镜检查。
  CICC-Phage 噬菌体检测 20 人用基因治疗制品总论:应确保不存在其他细菌、真菌和噬菌体的污染。 生物制品各论菌种检定:应为典型形态,无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
  CICC-BIOM 生理生化 20 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:菌毒种的检定:生产用菌毒种应进行生物学特性、生化特性、血清学试验和分子遗传特性等的鉴定;细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:生产用菌种的种、属、型分类鉴定,包括形态、生长代谢特性和遗传特性;重组工程菌生产用菌种主种子批检定:一般应包括培养特性、菌落形态大小、革兰氏等染色方法镜检、生化反应。 人用基因治疗制品总论:2.3.3 细菌种子批:生化特性。 微生态活菌制品总论:菌种的属、种型分类鉴定,包括生长代谢特性检查。 生物制品各论菌种检定:平板划线应呈典型集落形态,无其他杂菌生长;染色镜检应为典型形态;生化反应符合菌种反应特性。 9204 微生物鉴定指导原则:初筛试验:常规的微生物鉴定,一般要先进行初筛试验确定待检测菌的基本微生物特征,将待检菌做初步分类,包括形态观察、染色镜检、重要的生化反应。
  CICC-Serum 血清学试验 20 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:血清学试验。 9204 微生物鉴定指导原则:表型微生物鉴定:血清学;溯源分析:有些微生物的溯源还需结合表型特征鉴定,如沙门菌属的血清型鉴定。
  CICC-MALDI MALDI-TOF质谱快速鉴定 5 9204 微生物鉴定指导原则:表型微生物鉴定:MALDI-TOF质谱法分析微生物蛋白鉴定系统。
  CICC-SStab 遗传稳定性 30 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:菌毒种的检定:应对生产用菌毒种已知的主要抗原表位的遗传稳定性进行检测,并证明在规定的使用代次内其遗传性状是稳定的;重组工程菌生产用菌种主种子批检定:整合基因稳定性试验。 人用疫苗总论:3.4基因工程疫苗种子批系统:应通过传代稳定性分析确定工程细胞的传代限度,种子库检定时应证明表达系统的遗传稳定性、目的基因表达稳定性和生产稳定性等。 人用重组DNA蛋白制品总论:2.2.4 细胞基质的遗传稳定性:应评估细胞基质的稳定性。应基于宿主细胞经长时间培养后表达产物分子的完整性,以及细胞基质表型和基因型特征的综合情况,确定生产用细胞的最高限定代次。  人用基因治疗制品总论:2.3.3细菌种子批:应检测细菌种子批多次传代后的基因型和表型的稳定性。 微生态活菌制品总论:3.1.3 种子批的检定:菌种在适宜培养基中,连续传代30代次后,将第30代培养物做种子批检定,全部检查结果应与原始菌种的特性一致。
  CICC-PStab 生产稳定性 30
  CICC-GStab 基因稳定性 30
  CICC-BSus 细菌药敏(琼脂扩散法/MIC法/Etest) 15 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:活菌制剂还应进行抗生素敏感性测定;重组工程菌生产用菌种主种子批检定:对抗生素的抗性。 人用基因治疗制品总论:2.3.3 细菌种子批:抗生素抗性检查。对于减毒细菌载体,应检测其对抗生素的敏感性。 微生态活菌制品总论:3.1.3 种子批的检定:抗生素敏感性试验采用琼脂扩散纸片法或其他适宜方法,应符合该菌种特性。 生物制品各论菌种检定:对抗生素的抗性应与原始菌种相符。
  CICC-YSus 酵母药敏(MIC法/Etest) 15
  CICC-FSus 小型丝状真菌药敏(MIC法) 15
  CICC-Virulence 菌种毒力 40 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:毒力试验。  人用疫苗总论:3.2细菌性疫苗种子批系统:毒力试验。 微生态活菌制品总论:3.1.3 种子批的检定:毒性试验是通过动物试验检查菌种是否存在不安全因素,以保证人体使用安全。 生物制品各论菌种检定:毒力试验。
  CICC-CW 细胞壁化学组分(DAP/糖) 8 9204 微生物鉴定指导原则:表型微生物鉴定:全细胞组分。
  CICC-MIDI 脂肪酸 15 9204 微生物鉴定指导原则:气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征。
  CICC-MetaC 代谢产物含量 10 微生态活菌制品总论:3.1.3 种子批的检定:细菌代谢产物——脂肪酸测定按照气相色谱法或其他适宜方法进行,应符合该菌种的特性。
  CICC-Count 活菌数测定 15 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:活菌数测定。 1105 非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法。 微生态活菌制品总论:附录2:活菌数测定。
  CICC-Ccount 杂菌检查 15 微生态活菌制品总论:附录3:杂菌检查法。
  CICC-Toxin 真菌毒素测定 20 9305 中药中真菌毒素测定指导原则:曲霉属、镰刀菌属和青霉属包括了绝大多数的产毒真菌,与曲霉属相关的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A等;与镰刀菌属相关的真菌毒素主要包括玉米赤霉烯酮、T-2毒素、呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)和伏马毒素等;与青霉属相关的真菌毒素主要包括展青霉素和桔青霉素等。目前真菌毒素的检测方法有薄层色谱法、酶联免疫测定法、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法。(2351 真菌毒素测定法)
  CICC-DValue 生物指示剂耐受性检查 30 9208 生物指示剂耐受性检查法指导原则:总芽孢计数,D值测定。
  CICC-BSeq 16S rDNA 3/7 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:菌毒种的检定:生产用菌毒种应进行生物学特性、生化特性、血清学试验和分子遗传特性等的鉴定;细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:生产用菌种的种、属、型分类鉴定,包括形态、生长代谢特性和遗传特性,16S rDNA序列测定。 微生态活菌制品总论:3.1.3 种子批的检定:可采用16S rRNA序列测定或其他适宜方法进行,应符合该菌种的遗传特性。 人用疫苗总论:3.2细菌性疫苗种子批系统:分子遗传标识。 9204 微生物鉴定指导原则:基因型微生物鉴定:16S 核糖体(16S ribosomal RNA)核酸测序;26S rRNA基因序列;内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)核酸测序;18S 核糖体(18S ribosomal RNA)核酸测序。(1001聚合酶链式反应(PCR)法,1021 细菌DNA特征序列鉴定方法) 9108 DNA测序技术指导原则 9109 标准核酸序列建立指导原则
  CICC-YSeq 26S rDNA D1/D2区 3/7
  CICC-FSeq1 5.8S rDNA ITS区 5/10
  CICC-FSeq2 18S rDNA 5/10
  CICC-GeneS 目的基因核苷酸序列 10 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:重组工程菌生产用菌种主种子批检定:目的基因序列测定;重组工程菌生产用菌种主种子批检定:外源基因与宿主基因的检定。 人用疫苗总论:3.4基因工程疫苗种子批系统:应证明遗传稳定性、目的基因表达稳定性和生产稳定性等。 人用重组DNA蛋白制品总论:2.2.3 细胞库的质量控制:核苷酸序列应与表达载体一致,并与所预期的表达蛋白质的序列吻合。 人用基因治疗制品总论:2.3.3 细菌种子批:对于基因修饰的细菌,其基因组的重要区域(如引入的治疗和调控元件,以及被人为改造的任何区域及其侧翼至少0.5kb内的区域)的序列应与理论预期相符。 生物制品各论菌种检定:目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。 9108 DNA测序技术指导原则
  CICC-WGS 全基因组测序 60 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:菌毒种的检定:建立生产用菌毒种种子批全基因序列的背景资料,生产用菌毒种主种子批应进行全基因序列测定;细菌性疫苗生产用菌种主种子批检定:全基因序列测定;重组工程菌生产用菌种主种子批检定:全基因序列测定,外源基因与宿主基因的检定,外源基因整合于宿主染色体的检定。 人用重组DNA蛋白制品总论:2.2.3细胞库的质量控制:应采用分子生物学或其他适合的技术对表达载体基因插入或缺失、整合位点数量等情况进行分析。 人用基因治疗制品总论:2.3.3细菌种子批:对于经基因改造的质粒不大于50kb,应进行全序列测定。2.3.4 质粒DNA, 基于风险分析和产品特性对每批质粒进行检测,包括质粒鉴别、基因组完整性。 9204 微生物鉴定指导原则:基因型微生物鉴定:全基因组核酸测序;溯源分析:全基因组核酸测序可以得到菌株核酸水平的全部遗传信息,结果更加客观准确,是溯源分析技术的发展趋势。
  CICC-PFGE 脉冲场凝胶电泳 25 9204 微生物鉴定指导原则:基因型微生物鉴定:多位点序列分型、核糖体分型分析;溯源分析:污染调查应以基因型特征鉴定为主,表型特征鉴定为辅。细菌16S rDNA基因核酸序列、ITS核酸序列、限制性核酸内切酶进行酶解的Southern杂交、脉冲场凝胶电泳。
  CICC-RiboTyp Ribotyping核糖体分型 15
  CICC-MLST MLST分型 20
  CICC-RAPD RAPD 15
  CICC-RepP Rep-PCR 15
  CICC-EricP Eric-PCR 15
  CICC-BoxP Box-PCR 15
  CICC-ARDRATyp ARDRA 酶切 10
  CICC-Pc 质粒检查 15 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:重组工程菌生产用菌种主种子批检定:质粒的酶切图谱。 人用基因治疗制品总论:2.3.3 细菌种子批:质粒限制性内切酶酶切图谱分析。2.3.4 质粒DNA, 基于风险分析和产品特性对每批质粒进行检测,包括质粒鉴别。 生物制品各论菌种检定:质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。
  CICC-Ppuri 质粒纯度 10 人用基因治疗制品总论: 2.3.4 质粒DNA:基于风险分析和产品特性对每批质粒进行检测,包括质粒纯度。
  CICC-Pquanti 质粒拷贝数 15 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:重组工程菌生产用菌种主种子批检定:外源基因拷贝数检定。 人用重组DNA蛋白制品总论:2.2.3细胞库的质量控制:应采用分子生物学或其他适合的技术对表达载体基因拷贝数情况进行分析。 人用基因治疗制品总论:2.3.3细菌种子批:对于转导质粒的细菌种子批,应检测质粒拷贝数。 生物制品各论菌种检定:质粒拷贝数。
  CICC-Pratio 有/无质粒细菌的比例 20 人用基因治疗制品总论:2.3.3细菌种子批:对于转导质粒的细菌种子批,应检测有/无质粒细菌的比例。
  CICC-Ppro 质粒产率 20 人用基因治疗制品总论:2.3.3细菌种子批:对于生产质粒用途的细菌种子批,应检查质粒产率;2.3.4 质粒DNA, 基于风险分析和产品特性对每批质粒进行检测,包括质粒含量。
  CICC-PLrate 质粒丢失率 20 生物制品各论菌种检定:质粒丢失率。如:人胰岛素,2.2.3.2如系大肠杆菌表达,发酵液应定期进行质粒丢失率检查。(3406 质粒丢失率检查法)
  CICC-DDH DNA-DNA杂交 15 9204 微生物鉴定指导原则:基因型微生物鉴定:DNA-DNA杂交
  CICC-GC (G+C)mol%(Tm值法/ HPLC法) 15 微生态活菌制品总论:遗传特性分析可采用细菌DNA的G+C mol%的含量测定或其他适宜方法进行,应符合该菌种的遗传特性。 9204 微生物鉴定指导原则:基因型微生物鉴定:DNA碱基比例(如G+C)。
  CICC-TPIdenti 目的产物的鉴别 20 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:重组工程菌生产用菌种主种子批检定:目的产物的鉴别。
  CICC-TPExpre 目的产物表达量 20 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:重组工程菌生产用菌种主种子批检定:目的产物表达量。
  CICC-GeneEF 基因表达水平和功能活性 20 人用基因治疗制品总论:2.3.3细菌种子批:对于引入的治疗基因,应检测其表达水平和功能活性。
  CICC-Generesi 外源性DNA残留 15 人用基因治疗制品总论: 2.3.4 质粒DNA: 基于风险分析和产品特性对每批质粒的质粒进行检测,包括宿主细胞DNA残留量。 生物制品各论菌种检定:外源性DNA残留。(3407 外源性DNA残留量测定法)
  CICC-Proresi 蛋白质残留 15 生物制品各论菌种检定:蛋白质残留。(3412 大肠埃希氏菌菌体蛋白质残留量测定法, 3412 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法,3414 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法 )
  1.  
CICC-StrainS 种子批系统建立 15 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:生物制品生产用菌毒种应采用种子批系统。菌毒种经检定后,应根据其特性,选用冻干、液氮、≤-60℃或适当的方法及时保存。
  1.  
CICC-StrainP 菌种专属保藏 15 生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制:菌毒种经检定后,应根据其特性,选用冻干、液氮、≤-60℃或适当的方法及时保存。保存的菌毒种传代、冻干、液氮、≤-60℃冻存均应填写专用记录。
  1.  
CICC-SIC 密封完整性验证 20 药品GMP指南:微生物侵入法。

四、新种鉴定专题

微生物新种发表对全球系统微生物学研究影响深远。中国已成为全球系统微生物学研究最活跃的地区,2017年《国际系统与进化微生物学杂志》(IJSEM)共发表微生物新种论文800余篇,其中中国作者发表论文300余篇,约占40%2018年起,IJSEM建议作者在发表新种时提供菌种全基因组测序(WGS)信息。CICC拥有丰富的新种鉴定服务经验,提供包括模式菌株引进、菌种鉴定分析、公开寄存、技术咨询等在内的新种发表“一站式”技术解决方案,检测项目通过ISO 17025实验室认可,检测结果国际互认,数据可靠性具有保障,服务客户在IJSEM上发表的新种论文已超百篇。

微生物新种发表检测项目

 

  鉴定手段

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  • (1)常规鉴定

    常规鉴定内容有形态特征和生理生化特征。形态特征包括显微形态和培养特征;理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应等。

  • (2)BIOLOG碳源自动分析鉴定

    BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础,检测微生物的特征指纹图谱,建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比,得出鉴定结果。

    该系统已获美国FDA认可,已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。

    BIOLOG是一种微生物菌种快速鉴定系统,涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。

  • (3)分子生物学鉴定

    应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系,是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室,配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备,以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA(D1/D2)序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列,提供科学的鉴定结果。

  • (4)API细菌数值鉴定系统

    API鉴定系统涵盖15个鉴定系列,约有1000种生化反应,目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中,可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列,通过软件将待测细菌与数据库参比,得出鉴定结果。

    CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)和相关细菌、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)和库克菌属(Locuria sp.)进行鉴定。

  • (5)功能性分析及功能基因

    CICC不断致力于工业微生物资源的功能及其功能基因研究,目前通过木聚糖酶、纤维素酶、葡萄糖异构酶、β-甘露聚糖酶等功能基因的克隆进行菌种产酶的功能性分析。应用gyrA、atpD及pheS等看家基因于微生物菌种鉴定,在某些种、亚种、株间有较好的分辨效果。

  • (6)RAPD、SSCP技术

    随着微生物菌种应用的进一步发展,在食品安全管理、生物产品出口认证、知识产权保护等行业需求日益增加,微生物菌种株水平的鉴别技术成为一个迫切需要解决的问题。

    CICC采用随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphism DNA,RAPD)技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)技术对微生物菌株进行鉴别。如采用RAPD技术能够对同一菌种原始菌株与诱变菌株进行鉴别,对诱变菌株知识产权保护具有重要意义;采用SSCP技术进行工业酒精酵母菌株的鉴别,此技术结合菌株发酵特性,在酒类生产的质量控制方面起到积极作用。

  • (7)TLC薄层层析

    CICC将TLC薄层层析技术应用于微生物菌种鉴定,进行细菌、放线菌细胞壁化学组分分析(氨基酸、糖),作为划分属特征的重要鉴定技术手段,起到了良好的辅助作用。

  • (8)全细胞脂肪酸分析鉴定系统

    采用Sherlock全自动细菌鉴定系统,通过对不同菌株的脂肪酸图谱进行分析,并与标准数据库进行比对,来鉴定细菌及酵母。该技术是细菌或酵母种水平鉴定的有效手段之一。

  • (9)(G+C)mol%及DNA/DNA杂交

    CICC通过采用DU800核酸蛋白分析仪测定Tm值,从而得到微生物菌株的(G+C)mol%,并与模式菌株进行DNA/DNA同源性分析,该鉴定技术手段是多相鉴定的重要组成部分。

  • (10)实时荧光定量PCR

    实时荧光定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化系统,其将PCR热循环、荧光检测和各种应用分析软件结合在一起,可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。根据荧光强度确定PCR产物的定量法主要有荧光染料(SYBR Green I)法和荧光探针(Taqman probes)法。与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。实时荧光定量PCR技术目前已得到广泛应用,包括基于相对定量分析的基因表达分析,以标准曲线为基础的菌株绝对定量分析,定性的PCR扩增后核酸序列的SNP基因型分析,以及以阳性内对照为基础的阳性/阴性结果判定等。

  • (11)微生物菌群分析(DGGE)

    DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis),即变性梯度凝胶电泳,是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化,从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品,具有可重复和操作简单等特点,适合于调查种群的时空变化,并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。

  • (12)微生物菌群分析(克隆文库构建)

    当微生物菌群中含有不可培养或难培养菌种,且其丰度较低时,要全面解析菌群结构及多样性,只采用传统的平板分离或PCR-DGGE分析难以达到理想结果,这时可以结合构建16S rDNA 克隆文库的方法。细菌16S rDNA扩增产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳,EB染色,在UV下显现,从胶上切取DNA条带,经纯化后,链接到pGEM®-T Easy 载体,并转化入大肠杆菌(Escherichia coli)。待长出白色菌落后,挑选白色菌落进行菌落PCR-DGGE(16S rDNA V3)辅助筛选,得到特定菌群中的所有克隆菌,再经质粒提取,基因测序后,便可得到特定微生物菌群信息。

  • (13)细菌呼吸醌组分测定

    细菌细胞膜上的呼吸醌有甲基萘醌(menaquinone,MK)和泛醌(ubiquinone,辅酶Q)。对革兰氏阳性的放线菌而言,通常只含有甲基萘醌。常用来分析呼吸醌的方法有薄板层析法和高压液相色谱法等。醌分子中的多烯侧链长度及氢饱和度对于细菌具有重要的分类学意义。

  • (14)细菌磷酸类脂分析

     磷酸类脂(phospholipioides)属极性脂(polar lipid),与蛋白质、糖等构成细胞膜,对于物质运输、代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。不同属菌的磷酸类脂组分是不同的,它是鉴别属的重要特征之一,是化学分类项目中不可缺少的分类指征。磷脂种类很多,对于放线菌而言,具有分类学意义的磷酸类脂有5种:磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)、磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PC)、磷脂酰甲基乙醇胺(phosphatidylmethyl ethanolamine,PME)、磷脂酰甘油(phosphatidy glycerol,PG)及GluNU(含葡萄糖胺未知结构的磷脂,phospholipid of unknown structure containing glucosamine)。

 

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