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肉毒梭菌检测阳性对照菌

      肉毒梭菌(Clostridium botulinum),又称肉毒杆菌,是一种严格厌氧型梭状芽孢杆菌。肉毒梭菌是我国肉类罐头产品重点控制的有害微生物,因此在罐头食品的商业无菌检验中要求检测肉毒梭菌及肉毒毒素。

      目前,我国现行的肉毒梭菌及其毒素的检测标准有3个,分别为《GB/T 4789.12-2003 肉毒梭菌及肉毒毒素检验》、《SN/T 0865-2000 进出口食品中肉毒梭菌及其肉毒毒素检验方法》和《SN/T 2525-2010 食品中肉毒梭菌的PCR检测方法》。这三个标准方法中均涉及肉毒梭菌的增菌和分离培养过程。众所周知,我国相关标准和法规要求检测实验室应“通过标准培养物来验收培养基(包括试剂盒)、验证方法和评估实验操作”,因此,肉毒梭菌标准菌株的使用对于该菌株的正确检出具有重要作用。

      肉毒梭菌能分泌具有神经麻痹毒性的肉毒毒素,因此肉毒梭菌属国家严格管控菌种。在1985年卫生部颁布的《中国医学微生物菌种保藏管理办法》中将其列为二类,即”实验室感染机会较多、感染后的症状较重及危及生命,发病后不易治疗及对人群危害较大的传染病菌种”。2006年卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中,虽然将肉毒梭菌改为三类,但对菌株的管理要求却未放松,仍按二类管理。二类微生物属高致病性病原微生物,使用单位需具备相应防护条件,同时还要获得省级以上卫生行政部门审批。因此对于普通检测单位,不能获得标准阳性对照菌株,成为目前影响检测机构和相关食品企业自检的严重制约。

      为解决这个问题,中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)通过研究发现,生孢梭菌(Clostridium sporogenes)无论从形态学、生理生化方面,还是系统发育学角度,都与肉素梭菌亲缘关系最近。其培养特性与肉毒梭菌非常相似,但生孢梭菌属四类安全菌种,一般微生物学实验室皆可操作,无需特殊审批,可作为肉毒梭菌检测试验中培养基验证、方法学验证和样品增菌阶段的阳性对照菌株。

      肉毒梭菌可产生A、B、C、D、E、F、G共8个型的肉毒毒素,其中A、B、E、F型能引起人类疾病。中心构建了含有A、B、E、F等4类肉毒毒素基因的工程菌株,以满足检测单位采用分子生物学技术进行检测的需求。

附表1 生孢梭菌标准菌株特性

菌种编号

CICC 10385

菌种名称

生孢梭菌Clostridium sporogenes

形态学

 

G+,杆状,多单在,偶见成双或短链,两侧平行,两端钝园,直杆状或稍弯曲,芽胞为卵圆形,大于菌体宽度,位于次极端,使菌体呈匙形或网球拍状,偶有位于中央,常见很多游离芽孢。

 

在卵黄琼脂平板上菌落颜色呈白色,扁平,边缘为不规则,菌落呈珍珠层样,周围窄虹彩样薄层。

关键特性

35℃厌氧培养48h,生长良好。

35℃好氧培养48h,不生长。

 

附表2 肉毒毒素基因工程菌列表

CICC编号

宿主

原始编号

基因类型

10780G

大肠埃希氏菌DH5α

BontE

含肉毒梭菌typeE基因

10783G

大肠埃希氏菌DH5α

BontA

含肉毒梭菌typeA基因

10784G

大肠埃希氏菌DH5α

BontB

含肉毒梭菌typeB基因

10785G

大肠埃希氏菌DH5α

BontF

含肉毒梭菌typeF基因