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研究动态

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CICC菌种鉴定服务于食品、制药、化妆品和饲料行业

 

1.食品行业:

1.1益生菌类保健食品申报和安全性评价专题

益生菌是指活的微生物,当摄取足够数量时,对宿主健康有益。益生菌的保健功能具备菌株特异性,且需要摄入足够的数量才能达到预期的保健效果。2019年发布的《益生菌类保健食品申报与审评规定(征求意见稿)》要求申报者提供“株水平上具有功能作用的研究报告”和“菌种鉴定报告(包括表型特征和基于基因分型的菌株水平的鉴定结果)”;同时规定“益生菌类保健食品在其保质期内每种菌的活菌数目不得少于106CFU/mL(g)”,且“所用菌种(株)的生物学、遗传学、功效学特性应明确和稳定,菌种(株)及其代谢产物必须无毒无害”。同年发布的《保健食品用菌种致病性评价程序(征求意见稿)》规定企业须“提供由有菌种鉴定资质的检验机构出具的对拟评价菌种规范、科学的分类学(属、种、株名称或株号)资料。”菌种鉴定资料应包含“基于表型或最新基因测序技术确切鉴定到种水平的资料”和“动物致病性试验”及“产毒实验”的评价结果。《保健食品毒理学评价程序(征求意见稿)》规定“对益生菌、真菌等有特殊规定的保健食品,应按规定增加相应的试验,如菌种致病性试验。”

2019年5月,中国食品科学技术学会和中国营养学会均发布了益生菌科学共识,强调活菌数量和菌株特异性应作为益生菌的关键特征。

CICC是专业的益生菌鉴定和安全性评价服务机构,2019年6月,中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)顺利通过国家市场监督管理总局(原国家食品药品监督管理总局)“特殊食品验证评价技术机构备案”,备案编号:TY06211652。标志着中心获得了为保健食品企业提供菌种鉴定和菌种毒力试验检测,并出具第三方检测报告的国家法定许可。CICC将更好的服务于政府监管和行业需求,促进保健食品产业健康发展。

法规条文摘录 序号 类别 服务项目 工作周期(工作日) 备注
《益生菌类保健食品申报与审评规定(征求意见稿)》

 

第四条

 

(五)菌种鉴定报告(包括表型特征和基于基因分型的菌株水平的鉴定结果)。

 

《保健食品用菌种致病性评价程序(征求意见稿)》

 

第3条

 

3.2菌种分类学资料

 

提供由有菌种鉴定资质的检验机构出具的对拟评价菌种规范、科学的分类学(属、种、株名称或株号)资料。

 

3.3菌种鉴定资料

根据目前已有的知识,提供基于表型或最新基因测序技术确切鉴定到种水平的资料。

1、 多相鉴定 细菌鉴定 15 提供菌株分类学地位和生理生化特征的报告

2、

真菌鉴定 20

3、

酵母菌鉴定 15

4、

分子生物学鉴定 16s rDNA序列分析 7 仅提供菌株分类学报告。

5、

ITS rDNA序列分析 10

6、

26s rDNA序列分析 7

7、

快速鉴定 MALDI-TOF MS 3 快速的菌株分类学报告。

8、

菌株分型溯源 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 25 以特定目标菌株为参考菌株,提供送检菌株在株水平上的基因分型结果报告。

9、

核糖体分型

 

(Riboprinter)
15

10、

随机扩增DNA多态性(RAPD) 25

11、

多基因序列位点分析(MLST) 15

12、

全基因组测序(WGS) 60
《益生菌类保健食品申报与审评规定(征求意见稿)》

 

第四条

 

(六)菌种(株)的致病性试验、耐药性试验等安全性评价报告。

 

《保健食品用菌种致病性评价程序(征求意见稿)》

 

第4条

 

4.2全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)

4.3动物致病性试验

4.4 产毒实验

《保健食品毒理学评价程序(征求意见稿)》

5. 5.4 对益生菌、真菌等有特殊规定的保健食品,应按规定增加相应的试验,如菌种致病性试验

13、

安全性评价 遗传稳定性 30 菌株安全性评价报告。“动物致病性试验”即菌种毒力试验,“产毒实验”即毒素检测。

14、

细菌药物敏感性 15

15、

真菌/酵母药物敏感性 20

16、

菌种毒力 60

17、

溶血性 15

18、

全基因组测序(耐药、毒力基因分析;致病性分析) 60

19、

毒素检测 15

 

1.2新资源食品用菌种鉴定专题

2018年中华人民共和国国家卫生健康委员会发布了《食品安全国家标准 食品用菌种(行业内征求意见稿)》,是我国食品用菌种的首个国家标准规范。食品用菌种指“可用于食品中的一种或多种活的微生物(包括细菌、真菌和酵母),经发酵培养、分离、干燥或不干燥等工序制成的产品。按照用途,分为可直接食用菌种和食品发酵用菌种。” 企业“应使用经安全性评价后确认安全的菌种,确保其对人体健康不造成任何急性、亚急性、慢性或者其他潜在性危害。” 同年颁布的《食品用菌种生产卫生规范(征求意见稿)》对食品用菌种的要求做了更细致的规定:企业“外购的原始菌种或自行分离和收集的菌种,应进行菌种鉴定及遗传稳定性试验”。

CICC总结了新资源食品用菌种鉴定的相关服务,CICC将更好的服务于政府监管和行业需求,为食品企业生产菌种申报保驾护航。

 

法规条文摘录 序号 类别 服务项目 工作周期(工作日) 备注
《食品用菌种生产卫生规范(征求意见稿)》

 

7.3 食品用菌种

7.3.1 应使用国家相关法规允许使用的菌种。

7.3.2 外购的原始菌种或自行分离和收集的菌种,应进行菌种鉴定及遗传稳定性试验。

20、 多相鉴定 细菌鉴定 15 提供菌株分类学地位和生理生化特征的报告

21、

真菌鉴定 20

22、

酵母菌鉴定 15

23、

分子生物学鉴定 16s rDNA序列分析 7 仅提供菌株分类学报告。

24、

ITS rDNA序列分析 10

25、

26s rDNA序列分析 7

26、

快速鉴定 MALDI-TOF MS 3 快速的菌株分类学报告。

27、

菌株分型溯源 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 25 以特定目标菌株为参考菌株,提供送检菌株在株水平上的基因分型结果报告。

28、

核糖体分型

 

(Riboprinter)
15

29、

随机扩增DNA多态性(RAPD) 25

30、

多基因序列位点分析(MLST) 15

31、

全基因组测序(WGS) 60
《食品用菌种生产卫生规范(征求意见稿)》

 

7.3 食品用菌种

7.3.2 外购的原始菌种或自行分离和收集的菌种,应进行菌种鉴定及遗传稳定性试验。

 

《食品安全国家标准 食品用菌种(行业内征求意见稿)》

 

3.1.1菌种

 

应使用经安全性评价后确认安全的菌种,确保其对人体健康不造成任何急性、亚急性、慢性或者其他潜在性危害.

32、

安全性评价 遗传稳定性 30 菌株安全性评价报告。

33、

细菌药物敏感性 15

34、

真菌/酵母药物敏感性 20

35、

菌种毒力 60

36、

溶血性 15

37、

全基因组测序(耐药、毒力基因分析;致病性分析) 60

38、

毒素检测 15

 

2.制药和化妆品行业

2.1 2015中国药典、美国药典菌种鉴定专题

2015版《中国药典》逐步与国际水平接轨,针对微生物菌种管理、菌种检定、菌株分型、菌株溯源、生产过程微生物监测、环境微生物监测等内容进行修订和补充,对我国制药企业在微生物监控管理方面提出了新的要求和挑战。2015版《中国药典》提出了生物制品,微生态活菌制品中的生产检定用菌毒种管理规程,微生物鉴定指导原则(通则9204)为非无菌药品微生物限度控制菌检查中的疑似菌,药物原料、辅料、制药用水、中间体、终产品和环境中检出微生物的鉴定提供指导。国内化妆品企业亦可参照该原则进行菌种鉴定。

生物制品生产鉴定用菌毒种“系指直接用于制造和检定生物制品的细菌、支原体、立克次体或病毒等。2019年《生物制品生产检定用菌毒种管理规程国家标准修订草案公示稿》发布,对菌毒种主种子批的鉴定给出了详细的规定:“细菌性疫苗生产菌种主种子批鉴定一般应包括:培养特性、革兰氏等染色方法镜检、生化反应、血清学试验、毒力试验、免疫效价测定、培养物纯度、活菌数测定、16SrRNA序列测定、全基因序列测定等项目”

“微生态活菌制品系由人体内正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌,经培养、收集菌体、干燥成菌粉后,加入适宜辅料混合制成。” 2015版《中国药典》微生态活菌制品总论规定“菌种的属、种型分类鉴定,……,包括形态、生长代谢特性检查。原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素敏感性等检查。”

微生物鉴定指导原则(通则9204)指出微生物鉴定“是药品微生物检验中的重要环节”,在药典通则中涉及到对检出微生物进行鉴定的章节有:“‘非无菌产品的微生物检查:控制菌检查(通则1106)’中选择培养基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定;”“ 无菌检查法(通则1101)’的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定,以判定试验是否重试;‘药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则(通则9205)’中建议对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定,以掌握环境微生物污染情况,有助于污染调查等。”

对于国际化妆品生产企业,美国药典通用资料<1113> MICROBIAL CHARACTERIZATION, IDENTIFICATION, AND STRAIN TYPING中规定如在产品基质、赋行剂、生产用水、生产环境、中间产品和终产品中检出微生物,应进行适当水平的微生物鉴定和分型。在药典通则中涉及到对检出微生物进行鉴定的章节有:Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms <62>,该章节规定选择培养基或诊断培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定和形态学特征的检查;Sterility Tests <71>,该章节规定如果在无菌检查中分离到的微生物经鉴定与无菌检查用到的材料或技术相关,则试验无效;Microbiological Control and Monitoring of Aseptic Processing Environments<1116>,该通用资料建议在环境监测项目中分离的微生物应及时鉴定以确保污染调查的顺利进行。

CICC针对客户需求,对制药和化妆品企业在生产过程中的微生物控制,以及新药申报生产菌种检测等方面开展技术服务。

法规条文摘录 序号 类别 服务项目 工作周期(工作日) 备注
《生物制品生产检定用菌毒种管理规程国家标准修订草案公示稿》

 

四、菌毒种的检定

 

生产菌毒种应进行生物学特性、生化特性、血清学试验和分子遗传特性等的检定。

 

细菌性疫苗生产菌种主种子批检定

 

生产菌种的种、属、型分类鉴定,包括形态、生长代谢特征和遗传特性。

 

《中国药典》2015版微生态活菌制品总论:

 

3.种子批的检定

 

菌种的属、种型分类鉴定,应根据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册和伯杰氏细菌命名手册的有关规定进行,包括形态、生长代谢特性检查。原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素敏感性等检查。

 

微生物鉴定指导原则(通则9204)

 

美国药典通用资料<1113> MICROBIAL CHARACTERIZATION, IDENTIFICATION, AND STRAIN TYPING
1、 多相鉴定 细菌鉴定 15 提供菌株分类学地位和生理生化特征的报告。

2、

真菌鉴定 20

3、

酵母菌鉴定 15

4、

分子生物学鉴定 16s rDNA序列分析 7 仅提供菌株分类学报告。不能提供“型分类鉴定报告”

5、

ITS rDNA序列分析 10

6、

26s rDNA序列分析 7

7、

生理生化 细菌药物敏感性 15 《生物制品生产检定用菌毒种管理规程国家标准修订草案公示稿》

 

四、菌毒种的检定

 

活菌制剂还应进行抗生素敏感性测定。

8、

真菌/酵母药物敏感性 20

9、

菌种毒力 60 《生物制品生产检定用菌毒种管理规程国家标准修订草案公示稿》

 

细菌性疫苗生产菌种主种子批鉴定一般应包括:毒力试验

10、

快速鉴定 MALDI-TOF MS 3  

11、

 

代谢产物含量测定 10 《中国药典》2015版微生态活菌制品总论:

 

3.种子批的检定

 

除另有规定外,原始种子或种子批还需进行以下检查:

 

(1)细菌代谢产物—脂肪酸测定。
《生物制品生产和检定用菌种、毒种管理规程》

 

四、菌毒种的检定

 

4.应建立生产用菌毒种主种子批全基因序列的背景资料,减毒活疫苗主种子批应进行全基因序列测定。

 

12、

菌株分型溯源 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 25 以特定目标菌株为参考菌株,提供送检菌株在株水平上的基因分型结果报告。全基因组测序(WGS)提供菌株全基因序列的信息。

13、

核糖体分型

 

(Riboprinter)
15

14、

随机扩增DNA多态性(RAPD) 25

15、

多基因序列位点分析(MLST) 15

16、

全基因组测序(WGS) 60
《生物制品生产和检定用菌种、毒种管理规程》

 

四、菌毒种的检定

 

1.生产用菌毒种应按各论要求进行检定

 

5.应对生产用菌毒种已知的主要抗原表位的遗传稳定性进行检测,并证明在规定的使用代次内其遗传性状是稳定的。

 

《生物制品生产检定用菌毒种管理规程国家标准修订草案公示稿》

 

四、菌毒种的检定

 

细菌性疫苗生产菌种主种子批鉴定一般应包括:培养特性、革兰氏等染色方法镜检、生化反应、血清学试验、毒力试验、免疫效价测定、培养物纯度、活菌数测定、16SrRNA序列测定、全基因序列测定等项目

17、

生物制品各论菌种检定 目的基因核苷酸序列分析 20 《中国药典》2015版

 

<3400>生物测定法所列方法。

18、

质粒检查 15

19、

质粒拷贝数分析 15

20、

质粒丢失率 15

21、

DNA残留 15

22、

扫描电镜 15

23、

透射电镜 15

24、

遗传稳定性 30

 

 

3.饲料行业

3.1新饲料/饲料添加剂用菌种鉴定专题

国内饲料/饲料添加剂法律法规正逐步完善、规范和细化,《饲料和饲料添加剂管理条例(2017修订)》规定“研制的新饲料、新饲料添加剂投入生产前,研制者或者生产企业应当向国务院农业行政主管部门提出审定申请,并提供该新饲料、新饲料添加剂的样品和下列资料: (一)名称、主要成分、理化性质、研制方法、生产工艺、质量标准、检测方法、检验报告、稳定性试验报告、环境影响报告和污染防治措施;”《新饲料和新饲料添加剂管理办法(2016修订)》规定新饲料和新饲料添加剂的申请资料包括:“有效组分、理化性质及有效组分化学结构的鉴定报告,或者动物、植物、微生物的分类(菌种)鉴定报告,微生物发酵制品还应当提供生产所用菌株的菌种鉴定报告。” 此外,《新饲料添加剂申报材料要求》《进口饲料和饲料添加剂登记申请材料要求》均规定:“对于微生物及其发酵制品,应进行生产菌株安全性评价。公认安全的菌株除外。”

CICC愿积极与饲料企业进行合作,协助企业进行新饲料/饲料添加剂用菌种申报,致力于为饲料行业企业提供专业、高效和热情的服务。

法规条文摘录 序号 类别 服务项目 工作周期(工作日) 备注
《新饲料和新饲料添加剂管理办法(2016修订)》

 

第七条第三项:“有效组分、理化性质及有效组分化学结构的鉴定报告,或者动物、植物、微生物的分类(菌种)鉴定报告,微生物发酵制品还应当提供生产所用菌株的菌种鉴定报告。”
1、 多相鉴定 细菌鉴定 15 提供菌株分类学地位和生理生化特征的报告。

2、

真菌鉴定 20

3、

酵母菌鉴定 15

4、

分子生物学鉴定 16s rDNA序列分析 7 仅提供菌株分类学报告。不能提供“型分类鉴定报告”

5、

ITS rDNA序列分析 10

6、

26s rDNA序列分析 7

7、

快速鉴定 MALDI-TOF MS 3  
《新饲料添加剂申报材料要求》

 

3 安全性评价试验报告

 

(4)菌株安全性评价报告

 

对于微生物及其发酵制品,应进行生产菌株安全性评价。公认安全的菌株除外。

 

《进口饲料和饲料添加剂登记申请材料要求》

 

4 菌株安全性评价报告

 

对于微生物及其发酵制品,应进行生产菌株安全性评价。公认安全的菌株除外。

8、

菌株分型溯源 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 25 以特定目标菌株为参考菌株,提供送检菌株在株水平上的基因分型结果报告。

9、

核糖体分型

 

(Riboprinter)
15

10、

随机扩增DNA多态性(RAPD) 25

11、

多基因序列位点分析(MLST) 15

12、

全基因组测序(WGS) 60

13、

安全性评价 遗传稳定性 30 菌株安全性评价报告。

14、

细菌药物敏感性 15

15、

真菌/酵母药物敏感性 20

16、

菌种毒力 60

17、

溶血性 15

18、

全基因组测序(耐药、毒力基因分析;致病性分析) 60

19、

毒素检测 15

 

 

4.新种鉴定专题服务

微生物新种发表对全球系统微生物学研究影响深远。中国已成为全球系统微生物学研究最活跃的地区,2017年《国际系统与进化微生物学杂志》(IJSEM)共发表微生物新种论文800余篇,其中中国作者发表论文300余篇,约占40%。2018年起,IJSEM建议作者在发表新种时提供菌种全基因组测序(WGS)信息。CICC拥有丰富的新种鉴定服务经验,提供包括模式菌株引进、菌种鉴定分析、公开寄存、技术咨询等在内的新种发表“一站式”技术解决方案,检测项目通过ISO 17025实验室认可,检测结果国际互认,数据可靠性具有保障,服务客户在IJSEM上发表的新种论文已超百篇。

序号 类别 服务项目 工作周期(工作日) 备注
1、 电镜检测 扫描电镜 15 形态学观察(形貌、表面)

2、

透射电镜 15 形态学观察(内部、附属结构)

3、

分子生物学鉴定 克隆测序 10 适用于细菌、酵母、丝状真菌

4、

(G+C)mol% 15 Tm值法/HPLC法

5、

DNA-DNA杂交 15 复性速率液相分子杂交法

6、

全基因组测序(WGS) 60 提供菌种全基因组测序(WGS)信息

7、

化学分析 脂肪酸 10 MIDI Sherlock鉴定系统

8、

极性脂 10 细菌TLC法

9、

细胞壁(糖、DAP) 10 细菌TLC法/HPLC法

10、

醌组分 10 细菌TLC法+HPLC法

11、

生理生化 API 15 API鉴定条

12、

BIOLOG 15 基于碳源代谢的鉴定系统

13、

生理生化(新种) 30 生理生化特征试验

14、

细菌药物敏感性 15 琼脂扩散法/MIC法/Etest

15、

真菌/酵母药物敏感性 20 MIC法